(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112569221 A(43)申请公布日 2021.03.30
(21)申请号 202011482448.3(22)申请日 2020.12.15
(71)申请人 天津中医药大学
地址 301616 天津市静海区团泊新城西区
鄱阳湖路10号(72)发明人 李楠 张晗 夏庆梅 刘志东
刘岩 杨益 赵志月 刘陶 朱姗 郭盼 祁东利 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代
理事务所 12201
代理人 陆艺(51)Int.Cl.
A61K 31/352(2006.01)A61P 17/16(2006.01)A61P 17/18(2006.01)
权利要求书1页 说明书12页 附图6页
A61K 8/49(2006.01)A61Q 17/04(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)
(54)发明名称
千叶素A在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途(57)摘要
本发明公开了千叶素A在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途，实验结果说明，千叶素A可提高UVB损伤的HaCaT细胞的增殖活性；降低UVB损伤HaCaT细胞内ROS含量，提高UVB损伤HaCaT细胞的抗氧化活性；减轻UVB损伤HaCaT细胞的凋亡发生；并且可以显著减轻皮肤光老化症状。实验结果说明，含有千叶素A的提取物可提高UVB损伤的HaCaT细胞的增殖活性。
CN 112569221 ACN 112569221 A
权 利 要 求 书
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1.千叶素A在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。
2.含有千叶素A的提取物在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。
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说 明 书
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千叶素A在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途
技术领域
[0001]本发明涉及千叶素A在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。
背景技术
[0002]衰老是机体逐渐丧失功能走向死亡的一个过程。皮肤作为机体的最大器官，是机体与外界环境的防御屏障，比其他器官更能直观和明显的反映衰老。皮肤衰老通常分为内源性和外源性衰老，外源性衰老主要由环境因素导致。紫外线(UV)辐射是引起皮肤衰老的主要环境因素，皮肤长期暴露于UV辐射之下，会加速老化，主要表现为表面粗糙，含水量和弹性降低，胶原蛋白减少，以及皱纹形成，即所谓的皮肤光老化(也称光老化)，严重者甚至诱发癌症。
[0003]皮肤光老化是一个复杂的生物化学过程，其发病机制与氧化应激、炎症反应以及基质金属蛋白酶高表达等机制有关。氧化应激是引起光老化的始动因素。光老化过程中会产生大量活性氧(ROS)，包括超氧阴离子、过氧化氢、单线态氧和羟自由基等。机体中存在相对完善的抗氧化系统，ROS的产生和清除处于一个平衡状态。过量的ROS导致氧化还原系统失衡，从而引起细胞内脂质、蛋白质和核酸的氧化性损伤，最终引发细胞凋亡和组织器官损伤。减少ROS的积累，维持抗氧化内环境的稳定，是防护皮肤免受UV损伤的重要一环。[0004]千叶素A(又名千层纸素A，木蝴蝶素A)属于黄酮类化合物，全称为5,7‑二羟基‑6‑甲氧基‑2‑苯基‑4H‑1‑苯并呋喃‑4‑酮，主要来源于中药杜仲。具有广泛的药理活性，具有抗肿瘤、抗炎、保护血管、保护神经细胞、改善记忆障碍、抗病毒等作用。到目前为止还未见将千叶素A用于制备防治皮肤光老化的药物或护肤品的报道。
发明内容
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供千叶素A在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。
[0006]本发明的第二个目的是提供含有千叶素A的提取物在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。
[0007]本发明的技术方案概述如下：
[0008]千叶素A在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。
[0009]含有千叶素A的提取物在制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。[0010]实验结果说明，千叶素A可提高UVB损伤的HaCaT细胞的增殖活性；降低UVB损伤HaCaT细胞内ROS含量，提高UVB损伤HaCaT细胞的抗氧化活性；减轻UVB损伤HaCaT细胞的凋亡发生；并且可以显著减轻皮肤光老化症状。[0011]实验结果说明，含有千叶素A的提取物可提高UVB损伤的HaCaT细胞的增殖活性。附图说明
[0012]图1为辐射剂量对HaCaT细胞内ROS释放量的影响图，其中，A、空白对照组B、照射剂
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量30mJ/cm2组C、照射剂量40mJ/cm2组D、照射剂量50mJ/cm2组E、照射剂量60mJ/cm2组，FL1信号强度代表ROS含量。
[0013]图2为千叶素A对UVB损伤HaCaT细胞内ROS释放量的影响图，其中，A、空白对照组B、模型组C、10‑1μM千叶素A组D、1μM千叶素A组E、10μM千叶素A组，FL1信号强度代表ROS含量。[0014]图3为千叶素A对UVB损伤HaCaT细胞凋亡的影响图，其中，A、空白对照组B、模型组C、10‑1μM千叶素A组D、1μM千叶素A组E、10μM千叶素A组，FL2信号强度代表早凋细胞量，FL3信号强度代表坏死细胞量。
[0015]图4为小鼠皮肤的HE染色图，其中，A空白对照组，B模型组。具体实施方式
[0016]千叶素A，购自南京普怡生物科技有限公司，含量≥98％。[0017]HaCaT细胞，购自北京协和细胞库。[0018]MEM培养基，青霉素‑链霉素，0.25％胰酶+0.02％EDTA，PBS磷酸缓冲液，均购自美国Gibco公司。
[0019]胎牛血清FBS，购自以色列Biolnd公司。[0020]培养皿(60*15mm)，购自德国effendorf公司。[0021]细胞培养板，购自美国Costar公司。[0022]CCK‑8试剂盒，购自日本Dojindo Lab公司。[0023]完全培养液，由MEM培养基加入10％胎牛血清FBS，1％青霉素‑链霉素混匀即得。[0024]ROS探针DCFH‑DA(D6883)，DMSO均购自美国Sigma公司。[0025]SOD测定试剂盒(WST‑1法)，CAT测定试剂盒(可见光法)，GSH‑PX测定试剂盒(比色法)，MDA测定试剂盒(TBA法)，均购自南京建成生物工程研究所。[0026]PE偶联Annexin V凋亡检测试剂盒I(559763)，购自美国BD公司。[0027]实施例1.含千叶素A的提取物的制备[0028]取干燥杜仲树皮3.15kg，用27L体积浓度为95％的乙醇水溶液作为提取溶剂，加热回流提取2次，每次2.5h，合并提取液浓缩至提取溶剂的一半，得浓缩液一；残留的药渣加入6L体积浓度为60％的乙醇水溶液作为提取溶剂加热回流提取2.5h，提取液浓缩至提取溶剂的一半，得浓缩液二；合并浓缩液一和浓缩液二后，减压蒸去乙醇直至浓缩液无乙醇味为止，冷冻干燥得固体提取物。取固体提取物200g加入蒸馏水得质量浓度为30％的提取物水溶液，依次用水饱和过的石油醚、水饱和过的氯仿萃取，得石油醚萃取物15.3g，氯仿萃取物38.4g。取氯仿萃取物35g用80ml氯仿溶解，与75g 100‑200目硅胶拌样均匀，自然晾干。另取200g100‑200目硅胶湿法装柱，石油醚‑丙酮＝9:1‑7:3梯度洗脱。每50mL接收一个流分，共接收105个流分，分别标示为1至105。第一梯度：石油醚‑丙酮＝9:1，每50mL为一个流分，共接20个流分，用溶剂1L；第二梯度：石油醚‑丙酮＝8:2，共接49个流分，用溶剂2.45L；第三梯度：石油醚‑丙酮＝7:3，共接36个流分，用溶剂1.8L。回收溶剂后，根据各流分溶解性不同，分别用氯仿、甲醇等溶剂溶解样品，放置以备进一步分离纯化。经柱层析洗脱后，根据TLC薄层色谱分析，选择量大而且相对集中的流分进行处理。对成分相同或相似的流分进行分离纯化。
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[0029]流分43‑56经分离纯化后，运用标准品对照、H NMR鉴定其中化合物含千叶素A，其
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质量含量为25％，浓缩，冷冻干燥得含千叶素A的提取物。[0030]实施例2
[0031]低剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)的制备[0032]按重量比取:[0033]千叶素A 0.01％、山俞酸甘油酯0.3％、辛酸三甘油酯0.15％、大豆卵磷脂0.3％、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯(卖泽52)1.82％、卡波姆9400.3％、甘油4.6％、羟丙甲基纤维素0.3％、尼泊金乙酯0.3％,余量是去离子水。[0034]制备方法：
[0035]将配方量的山俞酸甘油酯、辛酸三甘油酯于75℃水浴下溶于氯仿得溶液A；[0036]将配方量的大豆卵磷脂、千叶素A于75℃水浴下溶于无水乙醇得溶液B；[0037]A、B两种溶液混匀得溶液C；
[0038]将配方量的卖泽52于75℃水浴下溶于去离子水中得溶液D；[0039]在磁力搅拌(500r/min)下将溶液C缓慢注入溶液D中，继续搅拌至除去有机溶剂即得千叶素A的纳米结构脂质载体。[0040]再将配方量的卡波姆940、甘油、羟丙甲基纤维素、尼泊金乙酯溶于去离子水(配方量的去离子水减去配制溶液D时使用的去离子水)中，4℃溶胀12h，得空白凝胶。
[0041]接着将空白凝胶分别与千叶素A的纳米结构脂质载体按照1:1搅拌混匀，调pH至6.5即得低剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)。[0042]使用方法：一天一次，无需清洗。取适量直接外用涂抹于皮肤，[0043]实施例3
[0044]低剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)的制备[0045]用含千叶素A的提取物替代千叶素A，其它同实施例2，得到低剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)。[0046]实施例4
[0047]高剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)的制备[0048]按重量比取:
[0049]将实施例2中的千叶素A由0.01％调整为0.02％，其余均同实施例2制备高剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)。[0050]实施例5
[0051]高剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)的制备[0052]用含千叶素A的提取物替代千叶素A，其余均同实施例4制备高剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)。[0053]试验例1、千叶素A防治光老化的细胞实验[0054](1)建立细胞光损伤模型
[0055]采用美国Sigma公司的SH2B型紫外光疗仪，模拟UVB辐射皮肤损伤模型，光谱为280～320nm，强度为12.8mW/cm2。取对数生长期的HaCaT细胞，以完全培养液将细胞密度调整为1×105个/mL，接种于96孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。吸弃96孔板中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100μL PBS覆盖，用UVB光疗仪照射HaCaT细胞，照射剂量分别为30、40、50、60mJ/cm2，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO2的培养箱
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中孵育24h后，CCK8法检测细胞活力(见表1)、流式测定ROS释放量(见表2，图1)。
[0056][0057]
其中As代表实验孔(表示有细胞、CCK‑8溶液和被不同剂量UVB照射孔)的吸光度，Ab代表空白孔(表示有CCK‑8溶液、无细胞和UVB照射孔)的吸光度，Ac代表对照孔(表示有细
而无UVB照射孔)的吸光度。胞、CCK‑8溶液，
表1不同剂量UVB照射对细胞活力的影响
(n＝6)
[0058]
[0059]
[0060][0061]
***
P<0.001vs空白对照组
(n＝3)
表2不同剂量UVB照射后细胞ROS释放量的影响
[0062]
由表1、2可知，辐射强度为60mJ/cm2时，细胞活力下降至65.68％、ROS释放量达
215.61显示造模成功。[00](2)实验药物：千叶素A(Oroxylin A)[0065](3)提高UVB损伤的HaCaT细胞的增殖活性[0066]实验方法
[0067]取对数生长期的HaCaT细胞，以完全培养液将细胞密度调整至1×105个/mL后接种于96孔细胞培养板中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养待96孔板中细胞长至70％左右，随机分为正常组(空白对照组)、UVB照射组(模型组)、10‑1～10μM千叶素A溶液组、10‑1‑1μg/mL的含千叶素A的提取物溶液组，进行预给药24h。预给药时空白对照组和UVB照射组均给予完全培养液。吸弃96孔板中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100μL PBS覆盖，用UVB光疗仪照射模型组、10‑1～10μM千叶素A溶液组和10‑1‑1μg/mL的含千叶素A的提取物的溶液组，照射剂量为60mJ/cm2，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h后，CCK8法检测细胞增殖活性，结果见表3。[0068]千叶素A的分子量M＝284.26g/mol，10‑1～10μM千叶素A溶液组的配置如下：[0069]精密称定1.42mg千叶素A溶于500μLDMSO溶液中得1×104μM千叶素A储备液[0070]10μM(2.8426μg/mL)千叶素A溶液：取1×104μM千叶素A储备液用完全培养液稀释1000倍即得。[0071]1μM(2.8426×10‑1μg/mL)千叶素A溶液：取1×104μM千叶素A储备液用完全培养液
[0063]
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稀释10000倍即得。[0072]10‑1μM(2.8426×10‑2μg/mL)千叶素A溶液：取1×104μM千叶素A储备液用完全培养液稀释100000倍即得。
[0073]含千叶素A的提取物为混合物，10‑1～1μg/mL含千叶素A的提取物溶液的配置如下：[0074]精密称定1.01mg含千叶素A的提取物溶于1mLDMSO溶液中得1×103μg/mL含千叶素A的提取物的储备液[0075]1μg/mL含千叶素A的提取物溶液：取1×103μg/mL含千叶素A的提取物的储备液用完全培养液稀释1000倍即得。[0076]10‑1μg/mL含千叶素A的提取物溶液：取1×104μM千叶素A储备液用完全培养液稀释10000倍即得。
[0077]
表3千叶素A/含千叶素A提取物对UVB照射后细胞活性的影响(n＝18)
[0078]
P<0.001vs空白对照 ***P<0.001vs模型 **P<0.01vs模型由表3可知，千叶素A或
含千叶素A的提取物作用于UVB损伤的HaCaT细胞后，可显著提高其增殖活性。[0080](4)降低UVB损伤HaCaT细胞内ROS含量[0081]实验方法：取对数生长期HaCaT细胞以完全培养液调整至1×105个/mL的密度种到60mm培养皿中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待培养皿中细胞长至约60％左右后随机分为正常组(空白对照组)、UVB照射组(模型组)、10‑1～10μM千叶素A溶液组，进行预给药
预给药时空白对照组和模型组均给予完全培养液。吸弃培养皿中培养液，PBS清洗2次，24h。
每孔加入100μL PBS覆盖，用UVB光疗仪照射模型组和各浓度千叶素A溶液组，照射剂量为60mJ/cm2，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h后，流式细胞仪检测HaCaT细胞内ROS水平，结果见表4，图2。
[0079][0082]
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表4千叶素A对UVB照射后HaCaT细胞中ROS水平的影响(n＝3)
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[0083]
P<0.001vs空白对照 ***P<0.001vs模型由表4可知，千叶素A作用于UVB损伤的
HaCaT细胞后，可显著降低其ROS含量。[0085](5)提高UVB损伤HaCaT细胞的抗氧化活性‑超氧化物歧化酶[0086]实验方法：取对数生长期HaCaT细胞以完全培养液调整到1×105个/mL的密度种到60mm培养皿中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待培养皿中细胞长至约60％左右后随机分为正常组(空白对照组)、UVB照射组(模型组)、10‑1～10μM千叶素A溶液组，进行预给药24h。预给药时空白对照组和模型组均给予完全培养液。吸弃培养皿中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100μL PBS覆盖，用UVB光疗仪照射模型组和各浓度千叶素A溶液组，照射剂量为60mJ/cm2，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h后，采用试剂盒进行超氧化物歧化酶(SOD)水平检测，结果见表5。
[0087][0088][00][0090]
[0084]
###
按SOD测定试剂盒(WST‑1法)说明书操作。
表5千叶素A对UVB照射后HaCaT细胞中SOD活力的影响
(n＝3)
[0091]
P<0.01vs空白对照 *P<0.05vs模型 **P<0.01vs模型[0093]由表5可知，千叶素A作用于UVB损伤的HaCaT细胞后，可显著提高其SOD活力。[0094](6)提高UVB损伤HaCaT细胞的抗氧化活性‑过氧化氢酶[0095]实验方法：取对数生长期HaCaT细胞以完全培养液调整至1×105个/mL的密度种到60mm培养皿中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待培养皿中细胞长至约60％左右后随机分为正常组(空白对照组)、UVB照射组(模型组)、10‑1～10μM千叶素A溶液组，进行预给药
[0092]
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24h。预给药时空白对照组和模型组均给予完全培养液。吸弃培养皿中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100μL PBS覆盖，用UVB光疗仪照射模型组和各浓度千叶素A溶液组，照射剂量为60mJ/cm2，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h后，采用试剂盒进行过氧化氢酶(CAT)水平检测，结果见表6。
[0096][0097][0098]
按CAT测定试剂盒(可见光法)说明书操作
表6千叶素A对UVB照射后HaCaT细胞中CAT活力的影响
(n＝3)
[0099]
P<0.01vs空白对照 *P<0.05vs模型[0101]由表6可知，千叶素A作用于UVB损伤的HaCaT细胞后，可显著提高其CAT活力。[0102](7)提高UVB损伤HaCaT细胞的抗氧化活性‑谷胱甘肽过氧化物酶[0103]实验方法：取对数生长期HaCaT细胞以完全培养液调整至1×105个/mL的密度种到60mm培养皿中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待培养皿中细胞长至约60％左右后随机分为正常组(空白对照组)、UVB照射组(模型组)、10‑1～10μM千叶素A溶液组，进行预给药24h。预给药时空白对照组和模型组均给予完全培养液。吸弃培养皿中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100μL PBS覆盖，用UVB光疗仪照射模型组和各浓度千叶素A溶液组，照射剂量为60mJ/cm2，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h后，采用试剂盒进行谷胱甘肽过氧化物酶(GSH‑Px)水平检测，结果见表7。
[0104][0105][0106]
[0100]
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按GSH‑PX测定试剂盒(比色法)说明书操作
表7千叶素A对UVB照射后HaCaT细胞中GSH‑Px活力的影响
(n＝3)
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[0107]
P<0.01vs空白对照 *P<0.05vs模型 **P<0.01vs模型
[0109]由表7可知，千叶素A作用于UVB损伤的HaCaT细胞后，可显著提高其GSH‑PX活力。[0110](8)提高UVB损伤HaCaT细胞的抗氧化活性‑丙二醛[0111]实验方法：取对数生长期HaCaT细胞以完全培养液调整至1×105个/mL的密度种到60mm培养皿中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待培养皿中细胞长至约60％左右后随机分为正常组(空白对照组)、UVB照射组(模型组)、10‑1～10μM千叶素A溶液组，进行预给药24h。预给药时空白对照组和模型组均给予完全培养液。吸弃培养皿中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100μL PBS覆盖，用UVB光疗仪照射模型组和各浓度千叶素A溶液组，照射剂量为60mJ/cm2，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h后，采用试剂盒进行丙二醛(MDA)水平检测，结果见表8。[0112]按MDA测定试剂盒(TBA法)说明书操作
[0113]
[0108]
##
表8千叶素A对UVB照射后HaCaT细胞中MDA含量的影响(n＝3)
[0114]
P<0.01vs空白对照 *P<0.05vs模型
[0116]由表8可知，千叶素A作用于UVB损伤的HaCaT细胞后，可显著降低其MDA含量。[0117](9)减轻UVB损伤HaCaT细胞的凋亡发生[0118]实验方法：取对数生长期HaCaT细胞以完全培养液调整至1×105个/mL的密度种到60mm培养皿中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待培养皿中细胞长至约60％左右后随机分为正常组(空白对照组)、UVB照射组(模型组)、10‑1～10μM千叶素A溶液组，进行预给药24h。预给药时空白对照组和模型组均给予完全培养基。吸弃培养皿中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100μL PBS覆盖，用UVB光疗仪照射模型组和各浓度千叶素A溶液组，照射剂量为60mJ/cm2，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h后，吸
[0115]
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弃细胞培养液，用PBS冲洗2次，加入0.25％的胰酶(含0.02％EDTA)消化5min，显微镜下观察细胞凸起变圆时，终止消化。离心收集细胞PBS洗2次，用1×Binding Buffer(试剂盒中试剂)重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/mL。取适量细胞悬液加入试剂盒PEAnnexin V和7‑AAD混匀，室温避光孵育15min后，使用Flow cytometer在1h内完成上样检测，结果见表9，图3。
[0119]表9千叶素A对UVB照射后HaCaT细胞凋亡的影响(x±SD)(n＝3)
[0120]
P<0.001vs空白对照 **P<0.01vs模型 *P<0.05vs模型
[0122]由表9可知，千叶素A作用于UVB损伤的HaCaT细胞后，可显著减轻其凋亡水平。[0123]试验例2、千叶素A防治光老化的动物实验[0124](1)建立光老化动物模型
[0125]先用剪刀和电动剃须刀剔除小鼠背部毛发，充分暴露其背部皮肤后，使用自制小鼠固定器固定小鼠后，SS‑03AB型光疗仪辐照小鼠造模。每周照射5天，休息2天，共辐照造模9周，总辐射剂量UVB总剂量：9.45J/cm2，UVA总剂量：94.5J/cm2。造模结束后，造模成功的小鼠背部皮肤明显增厚，皮肤表面粗糙，皮肤干燥变硬，可见明显皱纹，HE染色结果见图4。[0126](2)实验分组[0127]随机分成5组，分别为：空白对照组，8只，备皮，装置固定，不照射；模型组，8只，备皮，装置固定，照射；空白制剂(实施例2中制备的低剂量防治皮肤光老化的药物(或护肤品)中千叶素A的质量用去离子水代替即得)组，8只，备皮，装置固定，背部皮肤局部给予空白制剂，照射；低剂量千叶素A制剂组(实施例2制备)，8只，备皮，装置固定，背部皮肤局部给予低剂量千叶素A制剂，照射；高剂量千叶素A制剂组(实施例4制备)，8只，备皮，装置固定，背部皮肤局部给予高剂量千叶素A制剂，照射。[0128](3)千叶素A制剂对UV照射诱导的光老化小鼠皮肤水分的影响[0129]皮肤水分含量测试仪(Cornemeter CM 825,Courage and Khazaka，德国)的探头是基于电容的原理进行测量。水的介电常数是81，其他物质的介电常数通常小于7，水是皮肤上介电常数最大的物质。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面的含水量。测得值是一相对值。单位用C.U.(Corneometer Units)表示。
[0130]试验中，测试使用千叶素A制剂后，皮肤水分含量的变化。具体为:空白对照组不照
空白制剂组、高剂量千叶素A制剂组、低剂量千叶素A制剂组均进行紫外线照射，射，模型组、
照射条件见建立光老化动物模型中。一周照射5天，每周于照射5天结束后即第6天(即第6d，
[0121]
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12d，18d，24d，30d，36d，42d，48d，54d)测定皮肤含水量。分别使用皮肤水分含量测试仪测定测试区域的皮肤MMV值，每个测试区域测试3次取平均值。皮肤水分含量MMV值变化反映在测试周期内，实验区域水分含量随时间变化规律。其值越大，水分含量越大，反之，水分含量越小。测量结果如表10所示。
[0131]表10千叶素A制剂对UV照射诱导的光老化小鼠皮肤水分的影响(x±SD)(n＝8)
[0132]
P<0.001vs空白对照组 #P<0.05vs空白对照组 ***P<0.001vs模型组 **P<
0.01vs模型组 *P<0.05vs模型组[0134]从表10可以看出，在试验周期内，使用千叶素A制剂组的测试区的皮肤水分MMV值均高于模型组及空白制剂组。说明在实验周期内千叶素A制剂能增加光老化皮肤的含水量，改善光老化皮肤干燥症状。[0135](4)千叶素A制剂对UV照射诱导的光老化小鼠皮肤敏感度的影响[0136]组织活力成像仪(Tissue Viability Imager TiVi 700，WheelsBridge AB，瑞典)基于白光照明器发出的经过偏振光滤光片后的线性偏振光到达要分析的皮肤表面，大部分线性偏振光被皮肤表面直接反射后被探测器的滤光片阻碍，只有部分无规则的经过皮肤下
到达探测器的偏振光中，绿光层，经红血细胞吸收过后的偏振光通过了滤光片进入探测器。
成分由于血管中红血细胞的吸收作用被减弱，红色成分几乎没有被改变，而红血细胞周围的其他组织对绿光和红光的吸收基本相同。这样就可以得到皮肤深层的血管微循环状态，得到图像中每个点的红血细胞浓度值即TiVi值。TiVi 700系统就是利用血管中红血细胞对绿光吸收的特性，得到皮肤组织中红血细胞的分布聚集图像，红血细胞含量即代表皮肤敏感度。
[0137]试验中，测试使用千叶素A制剂后，皮肤敏感度的变化。具体为:空白对照组不照射，模型组、空白制剂组、高剂量千叶素A制剂组、低剂量千叶素A制剂组均进行紫外线照射，照射条件见建立光老化动物模型中。一周照射5天，每周于照射5天结束后即第6天(即第6d，12d，18d，24d，30d，36d，42d，48d，54d)测定皮肤敏感度。测量结果如表11所示。
[0133][0138]
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表11千叶素A制剂对UV照射诱导的光老化小鼠皮肤敏感度的影响(n＝
8)
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**P<0.01vs模型组 *P<0.05vs模P<0.001vs空白对照组 ***P<0.001vs模型组
型组
从表11可以看出，在试验周期内，使用千叶素A制剂组的测试区的皮肤敏感度值均
低于模型组及空白制剂组。说明在实验周期内千叶素A制剂能降低光老化皮肤的敏感度，改善光老化皮肤的高敏感性。[0142](5)千叶素A制剂对光老化小鼠皮肤黑色素含量的影响[0143]采用(4)中组织活力成像仪(Tissue Viability Imager TiVi 700，WheelsBridge AB，瑞典)拍摄图像，采用TiVi97色素分析软件分析黑色素含量。[0144]试验中，测试使用千叶素A制剂后，皮肤黑色素含量的变化。具体为:空白对照组不照射，模型组、空白制剂组、高剂量千叶素A制剂组、低剂量千叶素A制剂组均进行紫外线照
一周照射5天，每周于照射5天结束后即第6天(即第射，照射条件见建立光老化动物模型中。
6d，12d，18d，24d，30d，36d，42d，48d，54d)测定皮肤黑色素含量。测量结果如表12所示。
[0145][0141]
表12千叶素A制剂对UV照射诱导的光老化小鼠皮肤黑色素含量的影响
(n＝8)
[0146]
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P<0.001vs空白对照组 ##P<0.01vs空白对照组 ***P<0.001vs模型组 **P<
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0.01vs模型组 *P<0.05vs模型组[0148]从表12可以看出，在试验周期内，使用千叶素A制剂组的测试区的黑色素含量均低于模型组及空白制剂组。说明在实验周期内千叶素A制剂能降低光老化皮肤的黑色素含量，改善光老化皮肤的色素沉着问题。[0149]实验证明，用千叶素A，与药学常用辅料制成凝胶剂，乳膏剂，霜剂、乳剂或水剂，制成防治皮肤光老化的药物或护肤品可以提高光老化皮肤的含水量、降低其敏感度，减轻色素沉着。
[0150]以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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